III - L'INTÉRÊT DU CLONAGE ANIMAL REPRODUCTIF : RECHERCHE FONDAMENTALE ET APPLICATIONS MÉDICALES ET PHARMACEUTIQUES
1. Le clonage et la recherche biologique fondamentale
Le professeur THIBAULT énonce ainsi les faits fondamentaux concernant le fonctionnement du vivant sur lesquels les recherches relatives au clonage animal reproductif pourraient apporter des lumières 12 :
- Quels sont les facteurs qui, dans un ovocyte mûr, sont capables d'initier l'activation du génome de l'oeuf en développement à partir du stade 2, 4 ou 8-16 cellules ?
- Comment ces facteurs peuvent-ils aussi initier l'activation de la totalité du génome d'un noyau appartenant à une cellule différenciée qui n'était apparemment capable d'utiliser que des gènes codant pour des protéines spécifiques du tissu auquel il appartenait (protéines du lait pour la mamelle, kératine pour l'épiderme) ?
- Comment, au cours de la différenciation, s'éteignent les gènes qui ne seront plus utilisés et comment, corrélativement, s'activent les gènes spécifiques ?
De son côté, Jean-Paul RENARD souligne que l'étonnant pouvoir « reprogrammateur » que manifeste le cytoplasme de l'oeuf reste aujourd'hui peu compris. « Il met en jeu des remaniements complexes de l'organisation des protéines qui organisent le noyau (la chromatine) et impose des états de conformation étroitement contrôlés à la molécule support des gènes, l'ADN. Or cette plasticité fonctionnelle du génome des cellules différenciées se manifeste aussi quand des cellules acquièrent un comportement de cellules cancéreuses. Par exemple, des cellules cancéreuses bronchiques sécrètent des hormones présentes normalement dans l'hypophyse. Le clonage est donc, pour la recherche biomédicale, une voie supplémentaire de recherche pour une meilleure compréhension des mécanismes qui conduisent au dérèglement de l'activité des gènes. Il pourrait être riche d'enseignement pour des études de base sur la différenciation et le vieillissement cellulaires. » 13
Sur un ton plus caustique, Jacques TESTART observe quant à lui que la réussite du clonage apporte d'ores et déjà une démonstration scientifique qui « va à l'encontre de la mystification généralisée qui voudrait nous faire croire au tout-génétique : le clonage a démontré l'importance du facteur cytoplasmique pour contrôler l'expression du génome, c'est-à-dire la dépendance du génétique par rapport à des facteurs variés (épigénétiques, environnement) » 14 .
2. Les ressources offertes par l'association transgenèse-clonage
La naissance de la brebis Polly, annoncée par le Roslin Institute au cours de l'été 1997, fit moins de bruit que celle de Dolly, quelques mois plus tôt. Il est vrai que Polly avait été clonée à partir d'un fibroblaste de foetus, cellule moins différenciée que celle utilisée pour la création de son illustre congénère. Elle n'en constituait pas moins une nouveauté scientifique considérable puisqu'il s'agissait du premier gros mammifère cloné porteur du gène d'une protéine humaine : le facteur IX de coagulation 15 . Cette application concrète du clonage aux biotechnologies animales représente pour la transgenèse une avancée notable.
La création d'animaux transgéniques fait l'objet de recherches poussées depuis une dizaine d'années compte tenu des applications qu'elle peut offrir, d'une part pour la production de protéines thérapeutiques, d'autre part pour la transplantation chez l'homme d'organes « humanisés » susceptibles de surmonter l'obstacle immunitaire. Si les résultats sont restés jusqu'ici assez décevants, cela tient en partie à la faible efficacité des méthodes employées ; le recours au clonage par transfert nucléaire permettrait, selon les avis autorisés, d'accomplir sur ce point des progrès très sensibles.
2.1. L'efficacité escomptée du couplage transgenèse-clonage
La méthode de transgenèse la plus couramment appliquée jusqu'ici consiste à injecter un fragment génétique - une séquence d'ADN comportant un gène intéressant - dans un grand nombre d'ovules fécondés. Quelques chromosomes incorporent ce fragment d'ADN qui s'exprime alors dans cette cellule, dans les cellules filles, et chez l'animal après la naissance. Celui-ci transmet le fragment d'ADN à sa descendance.
Cette technique, dite de la micro-injection, est lente, imprécise et peu rentable : 1 à 4 % des animaux nés après de telles manipulations expriment la protéine recherchée. Si, en revanche, on modifie génétiquement les cellules utilisées comme donneuses lors d'un transfert nucléaire, le risque est nul d'obtenir un animal mosaïque dont les cellules de la lignée germinale n'ont pas intégré le transgène et qui ne peut, par conséquent, transmettre le nouveau caractère à sa descendance. La transfection des cellules avant le clonage permet aussi, en théorie, de modifier un génome de façon plus importante et plus précise en utilisant des chromosomes artificiels ou en réalisant un remplacement de gène.
D'après les chercheurs du Roslin Institute, le clonage, comparé à la micro-injection d'embryons, permet de diminuer d'un facteur 2,5 le nombre de brebis nécessaires à l'obtention d'un agneau transgénique.
Les cellules effectivement transfectées sont porteuses, outre le gène d'intérêt, d'un gène marqueur (codant par exemple une résistance à un antibiotique) et leur sélection est infiniment plus aisée à mettre en oeuvre que des tests de détection sur embryon. De plus, le sexe est prédéterminé par la cellule donneuse, ce qui présente un intérêt particulier lorsque l'animal destiné à produire dans son lait une protéine codée par le transgène doit être impérativement une femelle. En outre, des lignées de cellules donneuses adéquatement transfectées peuvent être conservées et stockées avant leur utilisation au moment opportun. On notera enfin que le recours au clonage permet, une fois l'animal transgénique créé, de le multiplier en diffusant son génotype 16 . Ainsi peut-on passer du cloné transgénique au transgénique cloné.
On signalera, pour conclure sur ce point, l'expérience de transgenèse spermatique réalisée en 1999 à Hawaï par l'équipe du docteur YANAGIMACHI 17 . Utilisant la technique de l'ICSI, les chercheurs ont injecté dans des ovocytes de souris des spermatozoïdes, débarrassés de leur queue et de leur membrane protectrice et mélangés à des fragments d'ADN codant un marqueur protéique fluorescent pour vérifier l'efficacité de la transgenèse. Les embryons issus de cette fécondation in vitro ont été transférés dans des souris porteuses. Près de 20 % des souriceaux qui sont nés se sont révélés porteurs dans leur génome d'une à plus de cinquante copies du gène marqueur. Ainsi a été démontrée la capacité d'un spermatozoïde nu de capter un gène étranger et de permettre son transfert dans le génome de l'embryon.
Selon Bernard JÉGOU, directeur à l'INSERM du groupe d'étude de la reproduction chez le mâle, « si la technique marche aussi bien sur le bétail que sur la souris, il est probable que les investissements sur le clonage d'adulte perdront une grande part de leur intensité » . 18
2.2. Transgenèse ciblée et création de nouveaux modèles animaux
Le clonage par transfert nucléaire peut être précédé d'une intégration ciblée du transgène dans la séquence d'ADN dont on souhaite modifier le fonctionnement. Ces stratégies d'intervention sur le génome sont déjà mises en oeuvre chez la souris à partir de cellules souches embryonnaires qui peuvent se maintenir en culture pendant de longues périodes mais conservent leur capacité de participer ensuite au développement. Ces outils cellulaires ne sont pas encore disponibles chez des mammifères plus proches de l'homme mais plusieurs laboratoires, dont celui de l'INRA, tentent d'obtenir ce résultat à partir de cellules foetales ou embryonnaires 19 .
La transgenèse ciblée est donc « une véritable microchirurgie génétique » 20 qui peut être utilisée pour fabriquer des modèles animaux de maladies humaines. On songe, dans un premier temps, à la mucoviscidose mais aussi, ultérieurement, au diabète, à la maladie de Parkinson et à la dystrophie musculaire pour lesquels on ne dispose pas, aujourd'hui, de traitements parfaitement efficaces.
Le marché des modèles animaux, indique Jean-Paul RENARD, est estimé aujourd'hui à environ 1 milliard de francs par an et intéresse évidemment les grands groupes pharmaceutiques et les équipes biomédicales. Il pourrait en outre s'ouvrir à des nouvelles demandes de nature très différente, telles que la production d'un lait de vache « maternisé » ou d'une viande sans prion.
2.3. La production de protéines thérapeutiques
« Un animal » , écrit Jean-Paul RENARD, « est un biotransformateur très efficace, capable de transformer des aliments simples, comme l'herbe, en composés complexes, comme le lait qui contient plus d'une centaine de protéines différentes. Plusieurs protéines de lait, comme les caséines ou la protéine du petit lait, ne sont produites que par les cellules de la glande mammaire car leurs gènes sont régulés par des séquences d'ADN ne fonctionnant que dans ce tissu. Si on associe ces séquences à celles de gènes codant pour une molécule d'intérêt thérapeutique [...], cette molécule sera produite dans le lait [...]. Disposer d'emblée, avec le clonage, de plusieurs animaux à forte production laitière comme la vache, c'est non seulement réduire le coût de production de la molécule, mais c'est aussi s'imposer rapidement sur de nouveaux marchés. » 21
Divers grands groupes financent une importante activité de recherche dans ce domaine avec la perspective d'un marché mondial dont la fourchette d'estimation se situe entre 40 et 55 milliards de francs. On citera ci-après quelques-uns des centaines de projets actuellement à l'étude.
Genzyme Transgenics (Framingham, Massachusetts, Etats-Unis) a rapporté récemment 22 le clonage, par transfert d'une cellule embryonnaire ayant intégré le transgène, de trois chèvres transgéniques produisant l' antithrombine III humaine , molécule présente dans le sang et dont le déficit génétique se traduit par la manifestation de thromboses veineuses postopératoires. Cette société possède ainsi des cellules embryonnaires en culture exprimant de manière constante le gène de l'antithrombine et peut reproduire, à la demande, un clonage identique. La chèvre présente le double avantage de produire plus de lait que la brebis - 300 kg de protéines purifiées sont envisageables annuellement - et d'être moins sujette que les ovins et les bovins au risque de développer une encéphalopathie spongiforme transmissible. Cette molécule pourrait être mise sur le marché dans les deux années à venir.
Genzyme a en outre passé un contrat avec ACT (Advanced Cell Technology, Worcester, Massachusetts), société spécialisée dans la culture de fibroblastes de bovins et le transfert nucléaire, pour la création de vaches transgéniques produisant de l' albumine , utilisée notamment en cas de chocs traumatiques et pour le traitement des grands brûlés et dont les besoins mondiaux sont de l'ordre de 400 tonnes par an, le prix de revient au gramme ne devant pas excéder 25 francs.
Un autre projet de Genzyme vise la production d'un anticorps pour traiter les rhumatismes articulaires . Un million de patients sont concernés aux Etats-Unis, chacun devant recevoir 5 grammes de substances actives par an. Cinq tonnes d'anticorps doivent donc être produites annuellement à un prix de revient inférieur à 50 francs par gramme. Jean-Paul RENARD indique qu' « en considérant une production de 1 gramme par litre de lait (après purification), 700 à 1 000 vaches (5 000 à 7 000 litres de lait par an) suffiront pour couvrir les besoins mondiaux » .
De son côté, Geron Bio-Med (filiale écossaise de Geron associé au Roslin Institute) devrait commercialiser d'ici deux ans la production de l' alpha-1 antitrypsine , protéine du foie dont la déficience génétique est génératrice d'emphysème pulmonaire et de cirrhose hépatique. Son administration peut en outre soulager les malades atteints de mucoviscidose. Ce marché est estimé à 100 millions de dollars.
Pharming (Leiden, Pays-Bas), qui a annoncé la naissance, en janvier 1999, de son premier veau transgénique cloné par transfert de noyau de cellules foetales, poursuit ses recherches sur la lactoferrine - protéine fixatrice du fer qui possède de nombreuses propriétés thérapeutiques et stimule notamment le système immunitaire - et l' alphaglucocidase (ou maltose), enzyme qui hydrolyse le maltose en glucose et permet de traiter les glycogénoses. Les vaches transgéniques destinées à la production de ces protéines seraient clonées avec la collaboration d'Infigen (De Forest, Wisconsin, Etats-Unis).
Plus futuriste est le projet de Nexia Biotechnologies (Montréal) associé à Genzyme, qui a cloné trois chèvres transgéniques dont le lait contient la protéine constitutive des fils de soie d'araignée . Ce biomatériau pourrait trouver des applications en chirurgie réparatrice mais aussi... dans l'industrie aérospatiale.
2.4. Transgenèse et xénogreffes
Nous avions indiqué dans notre précédent rapport que le marché des xénogreffes, destinées à pallier la pénurie de greffons d'origine humaine, est très porteur : les évaluations vont de 1,4 à 6 milliards de dollars d'ici à 2010 et la plupart des laboratoires s'appuient sur des firmes puissantes : Nextran et Alexian aux Etats-Unis ; Imutran au Royaume-Uni, racheté par Novartis, qui s'apprête à investir plus d'un milliard de dollars dans ce domaine.
La production de porcs « humanisés » dont les organes ne seraient pas exposés, lors de la transplantation, aux habituels phénomènes de rejet immunitaire, peut se trouver facilitée par le recours à la technique du clonage. Pour la réalisation de cet objectif, Imutran a signé, en janvier 1999, un accord de recherche avec Infigen visant à la production par clonage de lignées d'animaux transgéniques.
Alexion Pharmaceuticals (New Haven, Connecticut, Etats-Unis) a annoncé, en avril 1999, la transplantation réussie de neurones provenant d'un porc génétiquement modifié chez un modèle animal de la maladie d'Alzheimer. Elle compte passer à la clinique, s'alignant sur les xénogreffes déjà pratiquées chez l'homme par l'équipe d'Ole ISACSON, à l'Ecole médicale de Harvard et par des chercheurs de la société Dacrin (Charlestown, Massachusetts). Alexion collabore également avec Harvard pour le traitement de maladies neurodégénératives et avec l'Université Yale pour des xénogreffes destinées aux patients victimes de lésions de la moelle épinière 23 .
Il reste que la xénotransplantation soulève, comme nous l'avions indiqué dans notre premier rapport, bon nombre de questions scientifiques, juridiques, éthiques et sanitaires. L'un des aléas majeurs concerne la transmission à l'homme de zoonoses et de rétrovirus d'origine animale qui pourraient atteindre des proportions pandémiques. Sans entrer dans les détails d'un sujet qui déborde le champ de notre étude, on rappellera que la France est le seul pays européen à avoir mis en place un encadrement législatif 24 qui devra sans doute être précisé et complété à l'occasion de la révision de la loi du 29 juillet 1994. C'est l'une des recommandations contenues dans l'avis qu'a publié en juin 1999 le Comité consultatif national d'éthique. Ce document souligne par ailleurs l'intérêt de la création de porcs transgéniques tout en estimant qu'il convient de multiplier les essais expérimentaux de greffes d'organes de porcs transgéniques sur des singes qui représentent un excellent mais très coûteux modèle de xénogreffe humaine.
Plus récemment, ont été publiés 25 les résultats d'une étude conduite par une équipe d'Imutran qui portait sur 160 patients ayant reçu des tissus d'origine porcine - peau pour des brûlures graves, îlots pancréatiques pour un diabète - ou ayant bénéficié d'une circulation extracorporelle utilisant des cellules de porc (rate, foie, reins). L'objectif était d'établir les risques de contamination par le rétrovirus endogène porcin (PERV) et d'en déterminer les conséquences. Si l'on a bien retrouvé, chez 23 patients dont certains avaient été traités huit ans auparavant, la présence, dans la circulation, de cellules de porc, aucun signe d'infection n'a été établi, même chez 36 patients qui étaient pharmacologiquement immuno-déprimés.
Même si l'absence de tout risque sanitaire se trouvait confirmée, le problème du rejet que la transgenèse s'efforce de résoudre demeurera le principal obstacle au développement de la xénotransplantation. Selon Louis-Marie HOUDEBINE, spécialiste de la transgenèse animale à l'INRA, « il faudra peut-être supprimer ou ajouter au moins dix gènes chez les porcs pour adapter leurs organes à la greffe humaine, mais lesquels ? Si on les connaissait, la technique ne serait pas un frein » 26 . Il reste que, même si les chercheurs parviennent à maîtriser le rejet suraigu et le rejet vasculaire différé, ils devront également surmonter les rejets cellulaires retardé et chronique qui font intervenir des cellules du système immunitaire comme les lymphocytes et les macrophages. C'est dire qu'il convient d'envisager avec prudence les ressources thérapeutiques offertes par les animaux transgéniques dans le domaine de la transplantation d'organes.
3. Un développement industriel encore aléatoire compte tenu de la fragilité des résultats et des contestations touchant la propriété intellectuelle
La propriété intellectuelle des méthodes de clonage constitue à l'évidence un atout décisif dans la compétition commerciale qui oppose, des deux côtés de l'Atlantique, les grandes sociétés de biotechnologie.
Le Roslin Institute a déposé en 1997 deux demandes de brevets destinés à couvrir non seulement la technique qui a permis de créer le clone d'adulte et ses précurseurs mais aussi tous les dérivés de cette technique : les clones eux-mêmes, leurs descendants et leurs produits, qu'ils soient à usage agricole, pharmaceutique, chirurgical ou médical.
Ces demandes ont été homologuées en janvier 2000 par l'Office britannique des brevets. Deux autres brevets avaient été précédemment délivrés. Le premier, attribué en juillet 1998 à la firme australienne Pro Bio America, couvre la « technique de Honolulu » mise au point sur les souris par les docteurs YANAGIMACHI et WAKAYAMA. Elle procède par micro-injection de noyau et non par fusion de cellules, méthode utilisée par le Roslin Institute. Celui-ci n'a pas contesté la réalité de cette variante. Un litige sérieux l'oppose en revanche à ACT (Advanced Cell Technology) associé à l'Université du Massachusetts. Cette société s'est vu accorder en août 1999 par l'office américain un brevet couvrant le clonage de tout mammifère non humain, à partir de toute cellule somatique, foetale ou adulte, durant toute phase de croissance de la cellule, excepté la quiescence. C'est sur ce dernier point que porte la contestation : ACT affirme en effet avoir obtenu des veaux clonés à partir de cellules en cours de division 27 alors que Ian WILMUT considère que la quiescence des cellules donneuses conditionne la réussite du clonage et met en doute l'originalité de la méthode brevetée par la société américaine.
Ce conflit n'est qu'un épisode parmi d'autres de la guerre commerciale que se livrent, par partenaires interposés, ces deux « major companies » américaines de la biotechnologie que sont Geron et Genzyme pour la conquête d'un marché qui pèse plusieurs centaines de millions de dollars.
Cependant, par delà ces controverses juridico-scientifiques qui trouveront probablement leur épilogue devant les tribunaux, un autre élément hypothèque l'avenir industriel du clonage transgénique : même si les progrès rapides qui ont été enregistrés au cours de ces dernières années amènent certains commentateurs à évoquer une banalisation de la technique du clonage reproductif, ces avancées resteront sujettes à caution tant que des explications précises et d'éventuels remèdes n'auront pas été fournis sur le manque de résistance des animaux clonés.
Ces incertitudes ne remettront sans doute pas en cause la stratégie de grands groupes industriels attirés par la perspective de bénéfices colossaux. Elles devraient au moins tempérer l'optimisme d'une opinion publique trop souvent prête à tenir pour acquises des avancées scientifiques et médicales dont la promesse est encore en germe dans les éprouvettes des chercheurs. Cette observation vaut plus encore pour le clonage « thérapeutique » dont l'utilisation ouvre des perspectives jusqu'ici insoupçonnées mais dont la faisabilité demeure, pour l'instant, hypothétique.