La pépinière des Chartreux n'avait pas survécu à la tourmente révolutionnaire. Napoléon décida d'en constituer une nouvelle et instaura, en 1809, un enseignement arboricole public et gratuit, sous la forme de trois cours hebdomadaires, pendant six mois. Ces cours, délivrés par le conservateur du jardin ou ses auxiliaires, connaissent un grand rayonnement sous la IIIe République. Initialement limités à la culture et à la taille des arbres fruitiers, ils s'étendent au début du XXe siècle à la culture des plantes ornementales pour parcs et jardins.
En 1932, l'association des auditeurs des cours du Luxembourg se constitue pour offrir un prolongement et des compléments aux cours dispensés par la direction du jardin.
Si le fruitier sert de support et d'illustration au cours, ce n'est pas là sa seule fonction. C'est un lieu de recherche et de conservation d'espèces rares entouré de soins attentifs. Ainsi, des vols de fruits obligent-ils la direction à instaurer une surveillance de nuit pendant la période qui précède la récolte, en 1905. En 1929, on se plaint des promeneurs malveillants qui font tomber les fruits avec leurs cannes, lorsque ceux-ci ne sont pas gâtés par les becs gourmands des mésanges
A l'automne ces fruits sont l'objet d'une vente par adjudication, la maison d'alimentation Félix Potin se portant bien souvent acquéreur. La recette, dont une partie est reversée à des œuvres charitables (soupe populaire du 6e arrondissement, petites sœurs des pauvres), varie en fonction des récoltes, sujettes, comme partout, aux aléas climatiques. En 1936, par exemple, la grêle endommage les poires et anéantit la récolte de pommes.
Cependant, même les plus abondantes récoltes ne suffisent pas à assurer la rentabilité financière du fruitier, dont le coût d'entretien est élevé. Comme le souligne le jardinier en chef du Sénat, Octave Opoix, dans un rapport de 1921, son maintien se justifie surtout par son prestige, son intérêt pour le cours d'arboriculture - « le plus suivi de tout Paris » - et même son attrait touristique, car « beaucoup de personnes de la province venant à Paris ne le quitteraient pas sans faire une visite au jardin fruitier du Luxembourg. »